二甲双胍对胰腺癌BxPC-3细胞恶性表型的影响(1)
中图分类号R965
文献标志码A
文章编号1001-0408(2020)02-0202-06
DOI
10.603 9/j .issn.1001-0408.2020.02.14
摘要 目的：探索二甲双胍对胰腺癌BxPC-3细胞恶性表型的影响。方法：以Smad4基因天然缺失型人胰腺癌BxPC-3细胞为对象，采用CCK-8法和流式细胞术分别检测不同剂量二甲双胍(5、10、20 mmol/L)作用24h后的细胞增殖和凋亡情况，并计算细胞存活率和凋亡率;采用Transwell迁移试验检测不同剂量二甲双胍( 10、20 mmol/L)作用24h后的细胞迁移情况，记录迁移细胞數;采用实时定量聚合酶链反应法和Westem blotting法分别检测细胞中钙黏着蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、补体反应基因32(RGC-32)的mRNA及蛋白表达情况。结果：与对照组和5mmol/L二甲双胍组比较，10、20 mmol/L二甲双胍组细胞的存活率均显著降低，凋亡率均显著升高，且20 mmol/L二甲双胍组细胞的凋亡率显著高于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05)。与对照组比较，10、20 mmol/L二甲双胍组迁移细胞数均显著减少，且20 mmol/L二甲双胍组显著少于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05);10、20 mmol/L二甲双胍组细胞中E-cadherin mRNA及其蛋白的相对表达量均显著升高，且20 mmol/L二甲双胍组E-cadherin mRNA的相对表达量显著高于10 mmol/L二甲双胍组;10 mmol/L二甲双胍组细胞中Vimentin mRNA，20 mmol/L二甲双胍组细胞中Ⅵ一mentin mRNA及其蛋白以及10、20 mmol/L二甲双胍组细胞中RGC-32 mRNA及其蛋白的相对表达量均显著降低，且20 mmol/L二甲双胍组Vimentin mRNA及其蛋白、RGC-32 mRNA的相对表达量均显著低于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05或P<0.01)。结论：二甲双胍可剂量依赖性地通过Smad4非依赖性通路抑制BxPC-3细胞的增殖和迁移，促进其凋亡，这可能与胰腺癌细胞上皮间质转化过程以及RGC-32表达受到抑制有关。
关键词二 甲双胍;胰腺癌;BxPC-3细胞;增殖;凋亡;上皮间质转化;补体反应基因32
胰腺癌是一种早期诊断困难、进展迅速、预后极差的消化系统肿瘤，患者的5年生存率不到10%[1]。近年来流行病学研究显示，糖尿病是胰腺癌的危险因素之一[2-3]。多项研究表明，二甲双胍作为治疗2型糖尿病的一线治疗用药，可显著降低糖尿病患者发生胰腺癌的风险，并可显著延长胰腺癌患者的生存期，但并不能改善晚期或转移性胰腺癌患者的预后[4-7]。这提示二甲双胍可能对胰腺癌的早期治疗具有重要的临床意义。
目前学者普遍认为，上皮间质转化( Epithelial-mes-enchymal transition.EMT)是胰腺癌由早期发展至进展期的重要病理过程，其发生机制是目前研究的热点之一[8]。研究显示，有多条通路参与了胰腺癌的EMT过程，目前研究最多的是转化生长因子p(TGF-β)通路，该通路可通过其下游Smad依赖性和Smad非依赖性两种信号通路来诱导肿瘤细胞发生EMT[9]。其中，Smad4基因是Smad依赖性信号通路中的关键调节因子，也被认为是一种重要的抑癌因子[10];同时，相关研究指出，超过半数的胰腺癌患者存在Smad4基因缺失或失活，且后者与患者预后不良密切相关[11-12]。鉴于此，本研究拟通过检测不同剂量二甲双胍对Smad4基因天然缺失型胰腺癌BxPC-3细胞增殖、凋亡、迁移、EMT等生物学行为的影响，初步探讨该药对胰腺癌细胞上述恶性表型的影响及其基于Smad非依赖性通路的可能作用机制，以期为其抑制胰腺癌分子机制的阐释以及胰腺癌治疗新靶点的挖掘提供参考。
1 材料
1.1 仪器
HeaL Force HF151型C02培养箱、HeaL Force Neo-fuge13R型台式冷冻离心机(上海力康医疗设备有限公司);ChemiDoc XRS+型超高灵敏度化学发光成像系统、TlOO型聚合酶链反应(PCR)仪(美国Bio-Rad公司);StepOne型荧光定量PCR仪(美国ABI公司);CKX31-A12PHP型倒置相差显微镜(日本Olympus公司);NovoCyte 2060R型流式细胞仪(美国ACEA Bio公司);RT-6100型酶标仪(美国Rayto公司);DYCP-3IDN型电泳槽(北京六一仪器厂);TH2-98型温控摇床(江苏太仓创造电子有限公司)。
1.2 药品与试剂
盐酸二甲双胍对照品(批号：D9351，纯度：≥98.0%，后文简称“二甲双胍”)、胰蛋白酶一乙二胺四乙酸( EDTA)消化液、胰蛋白酶(不含EDTA)、胎牛血清、结晶紫染色液均购自北京索莱宝科技有限公司;RPMI 1640完全培养液(南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGM31800S-500);Trizol试剂、Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR混合液、BCA蛋白定量试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司;RIPA细胞裂解液(北京普利莱基因技术有限公司);超敏发光液(批号：RJ239676)、预染蛋白Marker(批号：26617)均购自美国Thermo Fish-er Scientific公司;CCK-8增殖检测试剂盒(日本Dojindo公司，批号：CK04);Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，批号：AP101-100-kit);小鼠抗人甘油醛一3一磷酸脱氢酶(GAP-DH)单克隆抗体(内参，批号：TA-08)、山羊抗小鼠IgG二抗(批号：ZB-2305)、山羊抗兔IgG二抗(批号：ZB-2301)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;兔钙黏着蛋白E(E-cadherin)多克隆抗体(美国Bioss公司，批号：bs-1519R);兔波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(英国Abcam公司，批号：ab92547);兔补体反应基因32(RGC-32)多克隆抗体(美国OmnimAbs公司，批号：OM227971);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司);磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4，上海帝博思生物科技有限公司);其余试剂均为市售分析纯，水为双蒸水。, http://www.100md.com(黄志铨 王振文 朱亮)
文献标志码A
文章编号1001-0408(2020)02-0202-06
DOI
10.603 9/j .issn.1001-0408.2020.02.14
摘要 目的：探索二甲双胍对胰腺癌BxPC-3细胞恶性表型的影响。方法：以Smad4基因天然缺失型人胰腺癌BxPC-3细胞为对象，采用CCK-8法和流式细胞术分别检测不同剂量二甲双胍(5、10、20 mmol/L)作用24h后的细胞增殖和凋亡情况，并计算细胞存活率和凋亡率;采用Transwell迁移试验检测不同剂量二甲双胍( 10、20 mmol/L)作用24h后的细胞迁移情况，记录迁移细胞數;采用实时定量聚合酶链反应法和Westem blotting法分别检测细胞中钙黏着蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、补体反应基因32(RGC-32)的mRNA及蛋白表达情况。结果：与对照组和5mmol/L二甲双胍组比较，10、20 mmol/L二甲双胍组细胞的存活率均显著降低，凋亡率均显著升高，且20 mmol/L二甲双胍组细胞的凋亡率显著高于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05)。与对照组比较，10、20 mmol/L二甲双胍组迁移细胞数均显著减少，且20 mmol/L二甲双胍组显著少于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05);10、20 mmol/L二甲双胍组细胞中E-cadherin mRNA及其蛋白的相对表达量均显著升高，且20 mmol/L二甲双胍组E-cadherin mRNA的相对表达量显著高于10 mmol/L二甲双胍组;10 mmol/L二甲双胍组细胞中Vimentin mRNA，20 mmol/L二甲双胍组细胞中Ⅵ一mentin mRNA及其蛋白以及10、20 mmol/L二甲双胍组细胞中RGC-32 mRNA及其蛋白的相对表达量均显著降低，且20 mmol/L二甲双胍组Vimentin mRNA及其蛋白、RGC-32 mRNA的相对表达量均显著低于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05或P<0.01)。结论：二甲双胍可剂量依赖性地通过Smad4非依赖性通路抑制BxPC-3细胞的增殖和迁移，促进其凋亡，这可能与胰腺癌细胞上皮间质转化过程以及RGC-32表达受到抑制有关。
关键词二 甲双胍;胰腺癌;BxPC-3细胞;增殖;凋亡;上皮间质转化;补体反应基因32
胰腺癌是一种早期诊断困难、进展迅速、预后极差的消化系统肿瘤，患者的5年生存率不到10%[1]。近年来流行病学研究显示，糖尿病是胰腺癌的危险因素之一[2-3]。多项研究表明，二甲双胍作为治疗2型糖尿病的一线治疗用药，可显著降低糖尿病患者发生胰腺癌的风险，并可显著延长胰腺癌患者的生存期，但并不能改善晚期或转移性胰腺癌患者的预后[4-7]。这提示二甲双胍可能对胰腺癌的早期治疗具有重要的临床意义。
目前学者普遍认为，上皮间质转化( Epithelial-mes-enchymal transition.EMT)是胰腺癌由早期发展至进展期的重要病理过程，其发生机制是目前研究的热点之一[8]。研究显示，有多条通路参与了胰腺癌的EMT过程，目前研究最多的是转化生长因子p(TGF-β)通路，该通路可通过其下游Smad依赖性和Smad非依赖性两种信号通路来诱导肿瘤细胞发生EMT[9]。其中，Smad4基因是Smad依赖性信号通路中的关键调节因子，也被认为是一种重要的抑癌因子[10];同时，相关研究指出，超过半数的胰腺癌患者存在Smad4基因缺失或失活，且后者与患者预后不良密切相关[11-12]。鉴于此，本研究拟通过检测不同剂量二甲双胍对Smad4基因天然缺失型胰腺癌BxPC-3细胞增殖、凋亡、迁移、EMT等生物学行为的影响，初步探讨该药对胰腺癌细胞上述恶性表型的影响及其基于Smad非依赖性通路的可能作用机制，以期为其抑制胰腺癌分子机制的阐释以及胰腺癌治疗新靶点的挖掘提供参考。
1 材料
1.1 仪器
HeaL Force HF151型C02培养箱、HeaL Force Neo-fuge13R型台式冷冻离心机(上海力康医疗设备有限公司);ChemiDoc XRS+型超高灵敏度化学发光成像系统、TlOO型聚合酶链反应(PCR)仪(美国Bio-Rad公司);StepOne型荧光定量PCR仪(美国ABI公司);CKX31-A12PHP型倒置相差显微镜(日本Olympus公司);NovoCyte 2060R型流式细胞仪(美国ACEA Bio公司);RT-6100型酶标仪(美国Rayto公司);DYCP-3IDN型电泳槽(北京六一仪器厂);TH2-98型温控摇床(江苏太仓创造电子有限公司)。
1.2 药品与试剂
盐酸二甲双胍对照品(批号：D9351，纯度：≥98.0%，后文简称“二甲双胍”)、胰蛋白酶一乙二胺四乙酸( EDTA)消化液、胰蛋白酶(不含EDTA)、胎牛血清、结晶紫染色液均购自北京索莱宝科技有限公司;RPMI 1640完全培养液(南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGM31800S-500);Trizol试剂、Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR混合液、BCA蛋白定量试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司;RIPA细胞裂解液(北京普利莱基因技术有限公司);超敏发光液(批号：RJ239676)、预染蛋白Marker(批号：26617)均购自美国Thermo Fish-er Scientific公司;CCK-8增殖检测试剂盒(日本Dojindo公司，批号：CK04);Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，批号：AP101-100-kit);小鼠抗人甘油醛一3一磷酸脱氢酶(GAP-DH)单克隆抗体(内参，批号：TA-08)、山羊抗小鼠IgG二抗(批号：ZB-2305)、山羊抗兔IgG二抗(批号：ZB-2301)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;兔钙黏着蛋白E(E-cadherin)多克隆抗体(美国Bioss公司，批号：bs-1519R);兔波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(英国Abcam公司，批号：ab92547);兔补体反应基因32(RGC-32)多克隆抗体(美国OmnimAbs公司，批号：OM227971);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司);磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4，上海帝博思生物科技有限公司);其余试剂均为市售分析纯，水为双蒸水。, http://www.100md.com(黄志铨 王振文 朱亮)
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